脂質(zhì)體的表征

脂質(zhì)體的表征

為了對(duì)脂質(zhì)體制劑進(jìn)行適當(dāng)?shù)馁|(zhì)量控制，需要在制備和儲(chǔ)存后對(duì)其進(jìn)行充分的表征。在分析和生物分析領(lǐng)域中應(yīng)用的脂質(zhì)體，主要特征包括平均粒徑和多分散系數(shù)、包封率和層狀度測(cè)定。其他常用的檢測(cè)參數(shù)包括通過Zeta電位測(cè)量表面電荷、通過差示掃描量熱法（DSC）測(cè)定相轉(zhuǎn)變等。這里詳細(xì)給出了參數(shù)的表征方法。

◆ 1. 脂雙層測(cè)定：

在該方法中，將磷脂膜沉積在電極上，隨后在電場(chǎng)作用下，水化幾個(gè)小時(shí)。盡管通過施加交流電和直流電能形成巨大的單層脂質(zhì)體，但直流電場(chǎng)有一定的不足，由于水電解而發(fā)生起泡。電形成法制備出的脂質(zhì)體80%是較完-美的單層脂質(zhì)體。

◆ 2.  脂質(zhì)體粒徑大小和粒徑分布：

脂質(zhì)體的平均直徑及其分布是脂質(zhì)體制劑的關(guān)鍵參數(shù)，尤其是當(dāng)它們通過非腸道給藥途徑或吸入給藥時(shí)更為重要。

采用不同的方法可考察脂質(zhì)體的平均大小和粒徑分布。這些技術(shù)包括顯微鏡觀察、靜態(tài)或動(dòng)態(tài)光散射、粒徑尺寸排阻色譜（SEC）和場(chǎng)流分離技術(shù)。

為了得到關(guān)于脂質(zhì)體在粒徑大小和分布方面的一些較好和可靠的結(jié)果，可使用包括透射電子顯微鏡（TEM）、冰凍蝕刻透射電鏡、負(fù)染色和冷凍電子顯微鏡等方法。

這些技術(shù)能夠?yàn)橹|(zhì)體提供準(zhǔn)確的結(jié)果，因?yàn)橛盟鼈兛捎^察脂質(zhì)體形態(tài)并且可以分辨不同大小的粒子。另一方面，樣品制備比較復(fù)雜。此外，由于使用這些方法，會(huì)產(chǎn)生偽影，引起收縮和變形，并且獲得代表性粒徑大小分布耗時(shí)較長(zhǎng)，因此，不適于常規(guī)測(cè)量。在樣品制備中多加注意可以解決部分問題，獲得可重復(fù)且準(zhǔn)確的結(jié)果。

最近，原子力顯微鏡（AFM）技術(shù)已被用于研究脂質(zhì)體形態(tài)、大小和穩(wěn)定性。AFM，為分辨率接近0.1nm的掃描探針顯微鏡，無須處理樣品，也能在自然環(huán)境中實(shí)現(xiàn)對(duì)小脂質(zhì)體的可視化，可得到脂質(zhì)體表面的高分辨率三維輪廓。

該技術(shù)可在不改變其原始存在形式的前提下，實(shí)現(xiàn)脂質(zhì)體可視化；必要的表面固定不會(huì)對(duì)樣品產(chǎn)生不利影響，而且探針本身也不會(huì)對(duì)脂質(zhì)體產(chǎn)生不-良影響。

AFM分析是一種相對(duì)無創(chuàng)的技術(shù)，功能強(qiáng)大，速度快。它可以提供有關(guān)形態(tài)、大小及脂質(zhì)體儲(chǔ)存期間可能發(fā)生聚集過程的信息。

◆ 3. 轉(zhuǎn)變溫度：

磷脂如兩親性分子具有在低于其熔點(diǎn)的溫度下經(jīng)歷熱致轉(zhuǎn)變的獨(dú)特特征。

1) 烴鏈的化學(xué)性質(zhì)極大地影響著轉(zhuǎn)變溫度；

2) 酰基鏈的長(zhǎng)度、烴鏈中不飽和度、分子的極性區(qū)域、烴鏈上甲基直鏈及懸浮介質(zhì)的性質(zhì)和離子強(qiáng)度對(duì)轉(zhuǎn)變溫度具有重要影響；

3) 當(dāng)鏈長(zhǎng)減小時(shí)，轉(zhuǎn)變溫度較低。同樣地，支鏈和龐大側(cè)基的存在及?；湹牟伙柡投纫步档土宿D(zhuǎn)變溫度；

4) 與反式-不飽和烴尾基相比，順式-不飽和烴尾基的轉(zhuǎn)變溫度較低；

5) 脂質(zhì)體的制備和應(yīng)用受磷脂膜的轉(zhuǎn)變和流動(dòng)性的影響較大；

6) 脂質(zhì)體囊泡的特性如聚集行為、蛋白質(zhì)結(jié)合模式和融合與滲透性由磷脂的轉(zhuǎn)變溫度決定。

較低的轉(zhuǎn)變溫度對(duì)脂質(zhì)體是有利的。與具有較低轉(zhuǎn)變溫度的磷脂相比，具有較高轉(zhuǎn)變溫度的脂質(zhì)體釋藥更慢。因此，脂質(zhì)體轉(zhuǎn)變溫度的測(cè)定對(duì)于具有所需性質(zhì)的制劑是至關(guān)重要的。為了測(cè)定磷脂的轉(zhuǎn)變溫度，廣泛采用DSC方法。   

◆ 4. 表面電荷：

脂質(zhì)體可以是中性的、帶正電的或帶負(fù)電的。

? 通過使用磷脂如磷脂酰乙醇胺或磷脂酰膽堿獲得中性表面囊泡。

? 具有帶負(fù)電荷表面的脂質(zhì)體可以用酸性磷脂如磷脂酸、磷脂酰絲氨酸、磷脂酰甘油或十六烷基磷酸酯獲得。

? 磷脂如二油?；?甲基銨丙烷或硬質(zhì)酰胺，用于制備帶正電荷表面的脂質(zhì)體。

表面電荷是一個(gè)重要參數(shù)，因?yàn)樗鼪Q定了脂質(zhì)體的包封率和穩(wěn)定性。當(dāng)脂質(zhì)體和帶電藥物之間存在靜電吸引力時(shí)，藥物包封率增加。脂質(zhì)體表面的電荷密度和各種離子與脂質(zhì)體的結(jié)合親和力可通過測(cè)量Zeta電位這一參數(shù)來確定。

◆ 5.  Zeta電位：

粒子的Zeta電位是粒子在特定介質(zhì)中獲得的總電荷。它是混懸狀態(tài)的粒子所表現(xiàn)出的物理性質(zhì)。人們?cè)缫颜J(rèn)識(shí)到，Zeta電位的測(cè)量通常用于預(yù)測(cè)膠體系統(tǒng)的穩(wěn)定性。如果混懸液中的所有粒子都具有較大的負(fù)或正Zeta電位，那么它們將傾向于相互排斥并且不會(huì)聚集。但是，如果粒子具有較低的Zeta電位值，那么斥力不足以防止粒子絮凝。
對(duì)于Zeta電位測(cè)定，使用激光來作為照射樣品內(nèi)的粒子的光源。入射激光束穿過樣品池的中心，并檢測(cè)到約13°角的散射光。當(dāng)向池內(nèi)施加電場(chǎng)時(shí)，任何移動(dòng)通過測(cè)量容積的粒子將產(chǎn)生光的波動(dòng)信號(hào)，其頻率與粒子速度成比例。將該信號(hào)傳遞給數(shù)字信號(hào)處理器，然后經(jīng)計(jì)算機(jī)計(jì)算，從而得到Zeta電位數(shù)值。

◆ 6. 脂雙層流動(dòng)性：

脂雙層流動(dòng)性研究是考察磷脂分子鏈在雙層中的動(dòng)力學(xué)行為和有序性。脂質(zhì)體的組成影響脂雙層的流動(dòng)性，這方面研究較廣泛。

向磷脂膜中添加膽固醇能降低脂肪酸烴鏈之間的范德華相互作用，從而防止脂質(zhì)體結(jié)晶，對(duì)脂雙層流動(dòng)性產(chǎn)生重要影響。同樣地，將一些流體脂質(zhì)添加到脂質(zhì)體雙層中，它們會(huì)干擾屏障功能，從而增加其流動(dòng)性并降低其轉(zhuǎn)變溫度。脂質(zhì)體的藥物釋放行為由脂雙層的數(shù)量、流動(dòng)性和滲透性決定。

關(guān)于脂雙層流動(dòng)性的研究使用了多種技術(shù)手段，包括H-NMR光譜、EPR和去極化熒光。其中，EPR是確定脂雙層流動(dòng)性和結(jié)構(gòu)變化的一種有效方法。

◆ 7.  體外藥物釋放：

可以使用透析法進(jìn)行體外藥物釋放。透析袋膜應(yīng)在經(jīng)過各種篩選后再選擇，不應(yīng)發(fā)生藥物吸附，并且膜應(yīng)該可以自由滲透活性成分（截留分子量不應(yīng)該是擴(kuò)散過程中的限制步驟）。將幾毫升適量的脂質(zhì)體分散液置于透析袋中，密封并置入含有釋放介質(zhì)的容器中。在持續(xù)磁力攪拌下將整個(gè)系統(tǒng)保持在37℃，封閉釋放介質(zhì)以避免溶解介質(zhì)蒸發(fā)。

在漏槽條件下進(jìn)行動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)。在不同的時(shí)期間隔取樣品，并通過高效液相色譜（HPLC）、分光光度計(jì)或任何其他簡(jiǎn)便的方法測(cè)定藥物。用新鮮的溶出介質(zhì)替換樣品同體積的釋放介質(zhì)，以使受體隔室的體積保持恒定。每個(gè)動(dòng)力學(xué)實(shí)驗(yàn)平行進(jìn)行3次，取平均值以確定藥物從脂質(zhì)體中的釋放曲線。

 ◆ 8. 包封率：

根據(jù)藥物的極性和溶解度，藥物可以多種方式與脂質(zhì)體相互作用。

藥物或生物活性物質(zhì)可以包封在脂雙層中，插入極性頭部基團(tuán)，吸附在膜表面上，通過疏水尾部錨定，或包封在內(nèi)部水性核心中。需要對(duì)脂質(zhì)體性質(zhì)進(jìn)行廣泛研究，以實(shí)現(xiàn)藥物的最大包封并能預(yù)期實(shí)現(xiàn)控制其釋放。

1、磷脂的制備和組成都影響脂質(zhì)體制劑的包封率。膽固醇在藥物包封中的作用也很重要，因?yàn)閷⑺尤肓字た梢蕴岣甙饴省?/span>

由于部分藥物仍保持游離狀態(tài)，并未被包封，在確定包封之前，必須從脂質(zhì)體制劑中除去游離藥物。

? 通過HPLC、熒光分光光度法和UV/VIS光譜法等分析技術(shù)對(duì)脂質(zhì)體包封的藥物進(jìn)行定量測(cè)定，

? 還可以使用熒光染料鈣黃綠素測(cè)定脂質(zhì)體的包封率。該方法通過添加鈷陽(yáng)離子對(duì)未包裹的鈣黃綠素進(jìn)行熒光猝滅，簡(jiǎn)單易行，在測(cè)定前不需要去除游離染料。

2、電子自旋共振光譜法也可用于確定脂質(zhì)體的包封率，加入順磁性試劑如鐵氰化物可使外部自旋標(biāo)記的標(biāo)記物顯著變寬。

3、還可以利用二維擴(kuò)散排序核磁共振光譜法考察包封率，測(cè)量原理基于包封和游離標(biāo)記物質(zhì)如蔗糖之間的擴(kuò)散系數(shù)差異。

4、也有學(xué)者提出一種快速簡(jiǎn)單的實(shí)驗(yàn)方法，使用1H-NMR結(jié)合pH敏感標(biāo)記化合物（高聚肌氨酸）來確定脂質(zhì)體的包封率，而無需物理分離游離包封標(biāo)記物。

PhD納米高壓均質(zhì)機(jī)、脂質(zhì)體擠出器，均質(zhì)和過濾擠出的壓力可調(diào)、溫度可設(shè)置，

可選用不同孔徑的過濾膜，可將各類載藥脂質(zhì)體處理到100nm以內(nèi)，粒徑均勻，且包封率高。